Вся библиотека >>>

Содержание книги >>>

 

Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп


Раздел: Медицина 

 

Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин

 

 

И. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE)

 

I. ВВЕДЕНИЕ

ТОТ факт, что вирусы гриппа обладают способностью агглютинировать эритроциты, сыграл большую роль в развитии наших представлений об этих инфекционных частицах. Гемагглютинация оказалась крайне удобным методом для идентификации, очистки и определения .концентрации вирусов. Кроме того, с (момента обнаружения явления гемагглю-тинацип 35 лет назад (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941) считается, что механизмы адсорбции вирусов гриппа на поверхность клетки-хозяина и на поверхность эритроцитов сходны. Следовательно, на выяснение вопроса о. том, жаким образом вирионы гриппа инициируют инфекционный процесс, в большой степени влияют наши знания .механизма взаимодействия этих ширионов с эритроцитами.

В течение нескольких лет после открытия гемагглютина-ции Hirst (1941, 1942а, Ь) выяснял основные закономерности этого явления. Было обнаружено, что гемагглютинация может быть использована не только для обнаружения вируса гриппа, но и для определения его концентрации, поскольку имеет 'место пропорциональность между гемагглютинирую-щей активностью препаратов и их летальной дозой для мышей. Кроме того, обработка аллантоисной жидкости эритроцитами приводит к параллельному уменьшению ее инфекционного титра и титра гемагглютинации. Было та.кже показано, что конвалесцентная сыворотка крови, нейтрализующая инфекционность, тормозит и гемагглютинацию. Таким образом, были получены простые и эффективные экспресс-методы для количественной оценки содержания вирусов и вирусспе-цифических антител.

Hirst показал также, что адсорбированные на эритроцитах вирусы могут быть элюированы при температуре 37 °С, а элюированные вирусы можно снова адсорбировать на свежих эритроцитах. Однако эритроциты, с которых вирус был элюирован, теряют способность адсорбировать на своей поверхности вирусы гриппа того же штамма. После мягкой тепловой обработки вирусные частицы теряют способность к элюции без изменения гемагглютинирующей активности. Эти экспериментальные данные указывают «а разрушение специфического рецептора клеточной 'поверхности ферментом, ассоциированным с вирусной частицей. Изучение природы этого рецептора (Hirst, 1948a, b; 1949a, b) доказало, что он является мукопротеидом, сходным с ингибиторами гематглю-тинации, которые к тому времени были обнаружены в обычной сыворотке крови (Hirst, 1942b; McCrea, 1946; Burnet, McCrea, 1946; Francis, 1947).

 



Эксперименты, проведенные Hirst, -были первым аргументом в пользу существования нейраминидазьг, входящей в состав вириона (более подробные данные о ней будут приведены в гл. 4). Поскольку в описанных опытах было показано, что процесс элюции не оказывает влияния на сами вирионы, фактически :был разработан метод очистки и концентрирования вируса гриппа. Детали такого метода, включающего циклы адсорбции и элюции, были отработаны вскоре после проведения этих экспериментов. (Hare et al., 1941, 1942; Francis, Salk, 1942). Метод используется до настоящего времени.

С открытием явления гемагглютинапии началась новая страница в истории вирусологии. Несоответствие между инфекционным титром и 'конечной точкой титрования в реакции гематглютинации привело von Magnus (1951) к открытию существования генетически неполноценных вирионов, дефектных интерферирующих вирусных частиц, названных фон-магнусовским вирусом.

В настоящее время известно, что молекулярными структурами, ответственными за гемагглютинирующую активность вируса гриппа, являются равномерно распределенные радиальные поверхностные выступы, образуемые субъединицами гликопротёида '(ом. гл. 2). Удаление этих выступов приводит к потере инфеюционности и гемагглютинирующей активности. Таким образом, взаимодействие гемагглютинина с клеточной мембраной является первым этапом инфекционного цикла. Однако, как будет показано в гл. 4, могут быть подобраны условия, при которых вирионы способны вызвать инфекционный процесс и при этом не агглютинировать эритроциты. Основная задача данной главы состоит в том, чтобы дать представление о всех биологических свойствах ассоциированного с вирусной частицей гемагглютинина и связать эти свойства с его структурой. Будет еще раз рассмотрено сходство между адсорбцией вирионов на клетку-хозяин и на эритроциты. Для решения этих задач будет описана сама реакция гемаг-глютинации, а также будут приведены общепринятые сведения о структуре гемагглютинина и его свойствах как в составе вириона, так и после изоляции из вирусной частицы.

II. РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛ ЮТИ НАЦИИ

А. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РЕЦЕПТОРА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Вирусы гриппа агглютинируют эритроциты за счет взаимодействия с гликопротеидом, в состав которого входит сиа-ловая кислота и который является компонентом мембраны эритроцитов. Этот вирусный рецептор был изолирован из стромы эритроцитов человека, а химический состав я физические свойства его были подробно изучены Winzler и соавт. (1969а). Рецептор является гликопротеидом, содержащим М-и N-групповые антигены крови (Kathan, Winzler, 1963; Мо-rawiecki, 1964; Kathan, Adamany, 1967). Рецептор, изолированный из клетки, является высокоэффективным ингибитором гемагглютинирующей активности вируса гриппа.

В табл. 8 приведены свойства изолированного рецептора и сиалогликопептида, отщепляемого от N-конца молекулы рецептора с помощью трипсина. Отщепляемый гликопептид не обладает ингибирующей активностью, хотя он и содержит большую часть сиаловой кислоты, гексозы и гексозамина, входящих в состав нерасщепленного вирусного рецептора (Winzler et al., 1967). Лолипептидная часть рецептора составляет только около 18% его массы. Почти половина аминокислотных остатков представлена сер ином и треонином. Углеводные -цепочки присоединяются .к этим двум аминокислотам с помощью О-гликозидной связи. С аспарагином они связаны N-гликозидной связью. Остатки сиаловой кислоты занимают в углеводных цепочках концевое положение и могут 'быть отщеплены от рецептора с помощью вирусной нейраминидазы (Kathan, Winzler, 1963). Отщепление сиаловой кислоты от молекул рецептора приводит к подавлению их способности ингибировать гемагглютинацию и способности являться М- и iN-групповыми факторами крови (Springer, An-sell, 1958). В случае отсутствия ъ среде детергентов наблюдается агрегация интактных молекул с образованием агрегатных форм с молекулярной массой около 590000. Ингибиторная активность, а также М- и N-групповая активность , крови увеличивается при агрегации (Springer, 1967).'Предполагается, что склонность к агрегации объясняется гидрофобной природой карбоксильного конца рецептора. С помощью обработки трипсином (Winzler, 1969a) и цианидом брома (Маг-chesi et al., 1972) от С-конца может быть отщеплен полипен-тид, в состав которого входят в основном гидрофобные аминокислотные останки и который нерастворим в водной фазе. Winzler (1969а, Ь) предположил, что вирусные рецепторы присоединяются к мембране эритроцитов с помощью гидрофобных областей карбоксильных концов и что сиалопептиды, расположенные на N-концах, локализуются в водной фазе, окружающей эритроцит, где они могут вступать во взаимодействие с вирусом гриппа, антителами против М- и N-анти-генов и трипсином. Определив количество молекул сиаловой кислоты, отщепл'яемой от эритроцитов при обработке трипсином, Winzler подсчитал, что каждый человеческий эритроцит содержит на своей поверхности около 106 молекул сиало-пептида. Однако число рецепторных точек эритроцита, вероятно, меньше числа молекул рецептора.

Howe и соавт. (1970) обнаружили, что (Меченные ферри-

тином антитела к очищенному рецептору не распределяются

равномерно по поверхности интактных клеток, а присоединяют

ся только к дискретным областям. Таким образом, рецеиторные

молекулы, вероятно, группируются в своеобразные «класте

ры», формируя на поверхности эритроцитов области, связы

вающие вирус.          .

Б. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГРИППА С ЭРИТРОЦИТАМИ

Присутствие сиаловых кислот на поверхности эритроцитов, по-видимому, является необходимым условием адсорбции на них вирусов гриппа, поскольку полное удаление их приво-

дит к тому, что эритроциты становятся неспособными к агглютинации (Hirst, 1950). Вирусные частицы также теряют способность связываться с искусственными мембранами, образованными фосфатидилхолином и гликопротеидами, если отщепить от их гликопротеидной части сиаловую кислоту (Tiffani, Blough, 1971). Количество сиаловой кислоты, необходимой для связывания, однако, варьирует в разных штаммах. Вирионы различных штаммов могут быть построены в определенные ряды по своей способности агглютинировать эритроциты, с которых 'были злюированы вирионы других штаммов (Burnet et al.., 1946).

Определяющая роль остатков сиаловой кислоты в процессе присоединения вирионов .к эритроцита1М была показана в экспериментах, проведенных Suttajit и Winzler (1971). От полигидроксильных боковых цепочек остатков сиаловой кислоты в гликопротеидах могут быть отщеплены один или два атома углерода с помощью мягкого периодатного окисления с последующим восстановлением с помощью бортидрида натрия. Полученные таким шособом (Модифицированные глико-протеиды обладают резко сниженной способностью к инги-бированию гемагглютинации1. Метилирование карбоксильной группы сиаловой .кислоты также снижает ингибиторные свойства глнкопротеида (Kilbourne et al., 1972). Таким образом, на адсорбцию вируса на эритроцитах, вероятно, влияют как зарядовые, так и общие конфигурационные свойства рецеп-торного гликопротеида.

В некоторых видах эритроцитов в процессе адсорбции вирионов участвуют содержащие сиаловую кислоту вирусные рецепторы, отличающиеся от описанных рецепторных глико-протеидов. По данным Winzler (1969a), вирусы гриппа сохраняют способность агглютинировать человеческие эритроциты, из которых сиалопептиды удаляют с помощью обработки трипсином. Поскольку известно, что дипосомы, содержащие ганглиозиды, могут связывать один из парамиксовирусов — вирус Сендай (Haywood, 1974), вполне вероятно, что именно сиализидированные гликолипиды, находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть причиной адсорбции вирионов гриппа. Haywood предположила, что рецепторные центры могут не содержать гликонротеидов, если в их состав входят ганглиозиды. Она считает, что эти гликолипиды при соответствующей их ориентации на мембране эритроцита могут создать упорядоченный слой молекул сиаловой кислоты, необходимый для вирусрецепторной активности. Однако свободная сиаловая кислота, свободные ганглиозиды и небольшие

углеводы, содержащие сиаловую кислоту, не ингибируют ге-магглютинацию (Hughes, 1973; Haywood, 1974).

В настоящее время имеется еще одно доказательство того, что молекулы, не содержащие в своем составе остатков сиа-ловых кислот могут играть роль в адсорбции вирусных частиц на эритроцитах. Некоторые штаммы вируса гриппа не элюируют с эритроцитов, хотя и отщепляют сиаловую кислоту от клеток, на которых они были адсорбированы (Tsvet-kova, Lipkind, 1966), и, наоборот, 'вирусы могут элюировать с некоторых клеток при отсутствии регистрируемого отщепления сиаловой кислоты (Tamm, 1954). В то время .как процесс связывания определяется только содержанием сиаловой кислоты в рецепторах, скорость элюции вируса должна определяться величиной нейраминидазной активности вирусной частицы. Это не всегда так (Choppin, Tamm, 1959, 1960; Tsvetkova, Lipkind, 1966).

Полученные данные -позволяют сделать вывод о том, что для агглютинации, помимо взаимодействия клеточных рецепторов с остатками сиаловой кислоты, требуется еще и взаимодействие их с компонентами клеточной мембраны. Степень взаимодействия вирусов и эритроцитов, вероятно, зависит как от общей архитектоники связывающих клеточных центров, так и от структуры вирусного гемагглютинина. Таким образом, достаточным условием гемагглютинации, ло всей видимости, является вхождение в состав данного центра необходимого числа остатков сиаловой кислоты, а также наличие структурной комплементарности между клеточной мембраной и вирусным гемагглютинином (Fazekas de St. Groth, Gottschalk, 1963; Springer et al., 1969).

В. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСОВ И АНТИТЕЛ, ОСНОВАННЫЕ НА ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

1. Количественное определение гемагглютинации

В связи с большим числом рецепторных молекул на поверхности эритроцита к каждой зритроцитарной клетке может присоединиться большое число частиц вируса гриппа. Было подсчитано, что один эритроцит морокой свинки может адсорбировать на своей поверхности около 7000 вирусных частиц (Bateman et al., 1955). Однако, если в системе существует ограниченное число вирионов, вирусные частицы и эритроциты образуют агрегаты, в которых оба участника реакции присутствуют в соотношении 1—20 вирусных частиц на один эритроцит (Tyrrell, Valentine, 1957; Seto et al., 1961; Hoyle, 1968).

Степень гемагглютинации, наблюдаемая с данным .количеством вируса, зависит от типа эритроцитов, штамма вируса, а также от температуры, рН и ионного состава среды. Тип используемых эритроцитных клеток является главным фактором, определяющим наличие или отсутствие гемагглютинации. В реакции могут быть использованы эритроциты позвоночных животных — птиц, амфибий и млекопитающих (Hoyle, 1968). Степень агглютинации клеток и количество вируса, которое они способны адсорбировать, варьирует в зависимости от вида, к которому принадлежит животное, и индивидуального представителя данного вида.

Вирусные частицы также различаются по своей способности вызывать гемагглютинацию. Таким образом, количественное описание реакции гемагглютинации зависит от наличия детальных сведений о всех компонентах используемой системы. Например, вирионы вновь изолированных штаммов гриппа (т. е. штаммы, которые прошли только несколько пассажей в лаборатории) часто имеют филаментозную форму, в то время как форма вирионов широко используемых лабораторных штаммов обычно сферическая. Вирусные частицы филаментозной формы могут теоретически агглютинировать большее число эритроцитов; таким образом, степень наблюдаемой агглютинации не обязательно отражает количество присутствующих в системе вирусных частиц.

Для всех вирусных штаммов наблюдаемая степень агглютинации зависит от двух противоположных реакций — адсорбции и элюции. Поскольку для адсорбции необходимы столкновения между эритроцитами и вирусными частицами, скорость этой реакции определяется концентрацией реагентов и почти не зависит от температуры. С другой стороны, элю-ция обычно представляет результат ферментной деструкции и поэтому является температурозависимым процессом. Вирусные штаммы, обладающие низкой нейраминидазной активностью, могут быть обнаружены по реакции гемагглютинации при 20 °С. Для штаммов же с высокой активностью нейраминидазы скорость злюции при 20 °С может быть достаточно высока, так что агглютинация может и не наблюдаться. Эффект агглютинации для таких вирусов может обнаруживаться -при 4°С или при 20 °С после деструкции ви-рионной нейраминидазы с (помощью мягкой тепловой обработки (Hirst, 1948b; Stone, 1949).

Разработано большое число различных методик для обнаружения гемагглютинации, индуцируемой вирусными частицами. Обычно кратные разбавления вируса инкубируют совместно со стандартной суспензией эритроцитов и наличие гемагглютинации выявляют визуально (Salk, 1944) либо с помощью денситометрии. В последнем случае опектрофото-метрические измерения смеси вирусов с эритроцитами проводят после стандартного периода инкубации для формирования осадка (Hirst, Pickels, 1942; Levine et al., 1953; Horsfall,1954; Drescher, 1957). Совсем недавно разработана методика, согласно которой агглютинацию выявляют количественно с помощью определения количества гемоглобина, высвобождаемого из эритроцитов, не подвергшихся агглютинации данным разведением вируса (Cohen, Belyavin, 1966). Количество гемоглобина определяли и регистрировали с помощью автоматического анализатора. Кроме того, разработаны методики определения концентрации субъединиц гемагглютинина (Drescher, 1966, 1967).

Из всех описанных методик наиболее часто применяют прямое визуальное определение конечной точки титрования по картине агглютинации. При этом обычно используют эритроциты цыпленка и кратные двойные разведения в пробирках или в лунках пластмассовых пластин (при этом реакция может быть проведена в микрообъеме). Когда необходимо провести более точное определение, либо используют метод кратных разведений, разработанный Horsfall и Tamm (1953), либо определяют конечную точку агглютинации с помощью денситометра. Стандартная ошибка конечного вирусного титра, определенного методом кратных разведений, составляет примерно 17% (Horsfall, Tamm, 1953). Drescher (1957) показал, что при использовании спектрофотометриче-ской методики ошибка составляет 3%.

2. Гемадсорбция

В связи с тем что вирионы триппа отделяются от клеток

путем отпочкования, вирусный гемагглютинин, локализован

ный на поверхности инфицированных клеток, может быть об'

наружен до сформирования вирусных частиц. Титр вируса

можно рассчитать с помощью: а) метода, основанного на

связывании эритроцитов с кленками путем определения ко

нечной точки титрования (Shelokov, 1958); б) подсчета

центров в монослое клеток, покрытых адсорбированными

эритроцитами (Hotchin et al., 1960); в) отделения фракции

клеток с адсорбированными на них эритроцитами (White

et al., 1965); г) определения количества гемоглобина в эрит

роцитах, адсорбированных на инфицированных клетках (Fin-

ter, 1964). Последние две методики не требуют, чтобы в ин

фицированных клетках впоследствии синтезировались полно

ценные вирусные частицы! Эти методики использовали для

обнаружения гемагглютинина на поверхности клеток HeLa

при абортивной инфекции, вызываемой вирусами гриппа

(Wong, Kilbourne, 1961; White et al., 1965), и для обнаруже

ния синтеза гемагглютинина температур©чувствительных му

тантов при непермиссивных температурах (Mackenzie, Dim-

mock, 1973).

3. Ингибирование гемагглютинации

Реакция гемагглютинации ингибируется как антителами, специфическими для вирусного гемагглютинина, так и рядом растворимых гликопротеидов, обнаруживаемых в сыворотке .крови и других жидких субстанциях организма. Торможение гемагглютинации, обусловленное либо специфическими антителами, либо неспецифическими веществами, выражается количественно с помощью метода, основанного на смешивании стандартного количества вирусных частиц с кратными разведениями исследуемой сыворотки и последующим добавлением в систему эритроцитов, и расчетом титра ингибитора по наибольшему разбавлению сыворотки, полностью подавляющей гемагглютинацию.. Неспецифические ингибиторы гемагглютинации, присутствующие в разных концентрациях в большинстве сывороток, необходимо удалить или разрушить перед определением количества специфических антител. Для этой цели обычно используют нагревание, обработку нейраминидазой, трипсином или иерйодатом. Неспецифические ингибиторы можно удалять с помощью ионообменников (Kilbourne et al., 1972b). Поскольку все указанные виды обработки могут, кроме того, снизить концентрацию специфических антител, используемый метод предварительно должен быть проверен на уже исследованном штамме вирусов и изученном типе сыворотки.

Г. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГРИППА С НЕСПЕЦИФИЧЕСКММИ ИНГИБИТОРАМИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Хотя присутствие в сыворотке неспецифических ингибиторов и создает дополнительные трудности при определении количества специфических антител, тем не менее их свойство блокировать гемагглютинацию можно использовать для изучения механизма взаимодействия вирусов с эритроцитами. Неспецифические ингибиторы разделяются по своему химическому составу и свойствам на а-, |3- и у-ингибиторы (Kriza-nova, Rathova, 1969). Один из них — а-ингибитор, или «ингибитор Фрэнсиса» (Francis, 1947), охарактеризован наиболее полно. Он представляет собой содержащий сиаловую кислоту гликопротеид, который ингибирует гемагглютинацию, но не влияет на инфекционный процесс. Его активность резко снижается при обработке нейраминидазой, но не исчезает после прогревания при 56 ЧС в течение 30 мин. Ингибитор |3-типа, или «ингибитор Чу» (Chu, 1951), вероятно, не содержит остатков сиаловых кислот; он инактивируется нагреванием при 56 °С в течение 30 мин, но не теряет свою активность при обработке нейраминидазой.

Различаются ли ингибиторы а- и у-типов настолько, чтобы оправданно относить их к разным классам, является предметом дискуссии (Kjlbourne et al., 1972b). Согласно классификации, предложенной Krizanova и Rathova (1969), ингибиторы а-ти'па в отличие от •у-ингибиторов инактивируются нейр-амияидазой. Однако обработка нейраминидазой может полностью снизить активность данного ингибитора для одного штамма вируса без изменения его активности для другого штамма. Кроме того, данный гликопротеид может ингибиро-вать гемагглютинирующую активность двух вирусных штаммов и снижать инфекционность только одного из них. Таким образом, к какому типу отнести обнаруживаемый ингибитор, частично зависит от штамма используемого для определения активности ингибитора вируса. В связи с тем что в таких исследованиях использовали большое число различных штаммов вирусов, вопрос о различиях между а и ^-ингибиторами в настоящее время является в некоторой степени спорным. Choppin (Kjlbourne et al., 1972) предложил, чтобы ингибиторы характеризовались по источнику выделения и по различиям в химических и физических свойствах (если эти различия известны), а не по типам ингибирования, наблюдаемого для данного штамма вируса.

Большая путаница в настоящее время существует в вопросе о роли ингибиторов в нейтрализации вируса. Поскольку предполагается, что рецепторы на поверхности клетки-хозяина и эритроцитов одинаковы то составу, ингибиторы гемагглютинации должны также снижать инфекционность вируса. Вирионы с присоединенными ж ним молекулами «-ингибитора не должны адсорбироваться на центры мембраны клетки-хозяина, содержащие в своем составе сиаловые кислоты, за счет зарядового отталкивания и стерических эффектов. Однако, поскольку известно, что вирионы гриппа инфек-ционны в присутствии а-ингибитора, было предположено, что адсорбция вирусов осуществляется уже после того, как ви-рионная нейраминидаза разрушит .комплекс между вирусной частицей и молекулой ингибитора (Kjrizanovs, Rathova, 1969). Можно было бы ожидать, что, если ингибиторы а-тина и будут снижать инфекционность вирусов триппа, это будет справедливо для штаммов с низкой нейраминидазной активностью. Как описано в тл. 4, инфекционность вирионов, не обладающих регистрируемой нейраминидазной активностью, увеличивается под действием по крайней мере одного ингибитора гемагглютинации, содержащего сиаловые кислоты. Поэтому не активность нейраминидазы, а, вероятно, какое-то

другое свойство вирионов ответственно за те различия, которые наблюдаются при их контакте с эритроцитами и клеткой-хозяином. Наши попытки изучить рецепторы клетки-хозяина, используя ингибиторы гемагглютинации, могут быть сходны с нахождением правильного решения при собирании разорванной картинки при условии, что мы не знаем, все ли имеющиеся фрагменты должны быть использованы для получения законченного изображения. В действительности, по-видимому, мы уже поставили некоторые фрагменты картинки в неправильное положение. Например, мы, вероятно, не должны рассматривать остатки сиаловой кислоты как существенную часть структуры клеточных рецепторов до тех пор, пока не попытаемся использовать для изучения необходимых условий адсорбции вируса не эритроциты, а саму клетку-хозяина.

III. СТРУКТУРА ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Общие аспекты структуры вируса гриппа, включая поли-пептидный состав вириона, (были уже рассмотрены в гл. 2. Здесь мы остановимся только на специальных вопросах структурной организации гемагглютинина. В частности, будут рассмотрены методы очистки этого гликопротеида, химический состав субъединиц, формирующих гемагглютинин, а также трехмерная структура активной формы этой молекулы.

А. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Для разрушения вирионов гриппа используют большое число детергентов: нонидет — Р40, тритон XI00, дезоксихо-лат натрия, саркозил NL30 и додецилсульфат натрия (SDS). Пороговая концентрация мицеллообразования первых четырех детергентов достаточно низка и поэтому используемые для разрушения вируса водные растворы их не денатурируют большую часть белков. С другой стороны, SDS иапользую'т в достаточно высоких концентрациях, при которых возникают денатурационные изменения в большинстве белков. Однако, несмотря на это, тем агглютинин некоторых штаммов вируса сохраняет свою активность при контакте с SDS (Laver, 1963). Одна из первых методик для отделения гемагглютинина от нейраминидазы без использования протеаз была основана именно на этой высокой стабильности темагглютинина (Laver, 1964). Додецилсульфат натрия денатурировал вирусные белки, отличные от гемагглютинина, которые мигрировали при рН 9,0 как анионы, в то время как гемагглютинин мигрировал как катион. Таким образом, гемагглютинин мог быть очищен с помощью электрофореза на ацетате целлюлозы.  С помощью этой методики был  очищен  гемагглютинин

вируса гриппа штамма Bel, и для него была получена обширная информация, описанная в етом разделе.

К сожалению, указанная методика не может быть использована для всех штаммов вируса гриппа. Гемапглютинин большинства штаммов денатурирует в (присутствии SDS. При использовании же других детергентов не денатурирует ни гемагглютинин, ни нейрахминидаза, но они не разделяются при электрофорезе. Гемагглютинин из этих штаммов может быть изолирован в чистом (виде только после получения ре-комбинантов с SiDS-чувствительной нейраминидазой. В связи с этим выделение темагглютинина из большинства штаммов вируса является довольно сложной задачей.

Гемагглютинин штамма Х-31, рекомбинанта H0N1-H3N2, получившего гемагглютинин и нейраминидазу от H3N2-po-дителя (Kilbourne, 1969), был извлечен из вируса с помощью бромелайна и очищен с помощью ультрацентрифугирования (Brand, Skehel, 1972). Гликопротеид, очищенный таким образом, образовывал кристаллы при вакуумном диализе против дистиллированной воды. Этот метод был успешно апробирован для некоторых штаммов вируса .гриппа А и В. Однако чистые белки, полученные этим способом, вероятно, отличаются от белков, присутствующих в вирионе, как по своей структуре, так и по функции.

Недавно были разработаны две методики, в которых для разрушения 'вируса использованы неденатурирующие детергенты с последующей хроматографией продуктов фрагментации вирионов на DEAE-целлюлозе в присутствии низких концентраций детергентов для поддержания .компонентов в не-агрегированном виде (Gregoriades, 1972; Stanley et al., 1973b). Эти методики еще не нашли широкого распространения, однако по теоретическим соображениям они должны иметь преимущества перед методам с использованием SDS для разрушения вирусных частиц с последующим электрофорезом. В связи с тем что при использовании описываемого метода разделения из одного и того же вирусного препарата изолируются как гемагглютинин, так и нейраминидаза, можно ожидать, что метод с использованием DEAE-целлюлозы найдет широкое применение для выделения из. большого числа штаммов препаративных количеств  вирусных антигенов.

Б. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СУБЪЕДИНИЦЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Гемагглютинин составляет 25—35% всех белков вириона. Эти данные 'были получены при анализе электрофоретических профилей в полиакриламядном геле, полученных для полипептидов четырех штаммов вируса гриппа типа А, культивированных на различных клетках-хозяевах (Schulze, 1973). Около 6% сухой массы вируса составляют углеводы (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959), большая часть которых ассоциирована с гемагглютинином. Таким образом, гемагглютинин представляет собой гликопротеид, 15—20% сухой массы которого представлены углеводами. Гемагглютинин формируется из субъединиц гликопротеида с молекулярной массой около 80 000, который был обозначен символом НА (Kilbourne et al., 1972а; см. также гл. 2). Поскольку химический состав олигосахаридов, ассоциированных с вирионом, определяется клеткой-хозяином, вирноны, культивированные на различных клетках-хозяевах, содержат молекулы гемаг-глютинина, различающиеся по своим размерам (Compans et al., 1970b; Haslam et al., 1970; Schulze, 1970).

При определенных условиях выращивания вируса из субъединицы НА путем ее протеолитичеекого расщепления формируются два гликолротеида HAi и НА2. Факторы, определяющие наличие такого расщепления, обсуждаются в гл. 2 и 8. Расщепление не является необходимым условием образования функционального «шипа» и не приводит к потере гемагглютинирующей активности и инфекционности (Laza-rowitz et al., 1971, 1973a; Stanley et al., 1973a). В субъединице НА, подвергшегося расщеплению, два тликопептида удерживаются в непосредственной близости друг от друга за счет существования дисульфидных мостиков и могут диссоциировать при совместном действии SDS и восстанавливающих агентов (Laver, 1971).

Определение молекулярной массы для HAi и НА2, изолированных из нескольких препаратов вируса, культивированного на одних и тех же клетках-хозяевах, показали, что эти гликопептиды варьируют по размерам от препарата к препарату не более чем интактиые субъединицы НА (Schulze, 1970). Однако полосы НА; и НА2 при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле обычно шире, чем полоса НА, что указывает на наличие гетерогенности обоих продуктов расщепления. Величины молекулярной массы HAi и НА2, полученные от двух штаммов вируса, культивированных на одних и тех же клетках, также могут различаться (Klenk et al., 1972; Stanley et al., 1973a). Таким образом, различие в последовательности аминокислот полипептида НА приво-- дит к различиям либо в месте расщепления, либо в распределении олигосахаридных цепочек вдоль молекул полипептидов. Расщепление, вероятно, возникает в одинаковых, ограниченных по числу, местах полипептидной цепи в случае культивирования вируса в определенных условиях. Гликопептиды HAi и НА2 могут быть получены с помощью обработки вирионов трипсином (Schulze, 1970; Lazarowitz et al., 1971, 1973a)  или плазмином   (Lazarowitz et al.,   1973b;  см. также гл. 2). В этих условиях расщепление должно приводить к образованию продуктов НА, и НА2; на С-конце одного из которых находится остаток аргинина или лизина.

1. Химический состав изолированных гликопептидов

Лротеолитичеекое расщепление субъединицы НА полезно для вирусологов (даже если этот процесс окажется не столь существенным для самого вируса), поскольку оно позволяет нам анализировать две части молекулы раздельно и описывать функции каждой из этих частей. Гликопептиды НА, я НА2 из штаммов АО/Bel H0N1 и B/Lee, культивированных на куриных эмбрионах, были разделены с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы; содержащем гуа-видиншдрохлорид и дитиотриэтол (Laver, 1971; Laver, Baker,   1972). 

НА2 выделенные из штамма АО/Bel после их деградации трипсином, свидетельствуют об отчетливых различиях, что в свою очередь указывает на отличие в их лоследовательно-стшяяашслот (Laver, 1971; см. также тл. 11, где «'писаны триптичеокие пептидные карты .гликолептидов НА, и НА2 пля долгих штаммов вируса).

Laver и Webster  (1972,  1973)    использовали    пептидные карты для выяснения молекулярных механизмов антигенных сдвигов в  гемагтлютинине.  Используя  только  триптические пептиды, растворимые при рН 6,5, они сравнили пептидные карты двух указанных выше гликопептидов, выделенные -из различных штаммов вируса гриппа тина А. В штаммах   ан-тигенно достаточно удаленных друг от друга, они обнаружили большую разницу в последовательности аминокислот как для НАь так и для НА2, а в близкородственных штаммах наблюдались только небольшие различия. Генетитакое объяснение этих результатов будет дано в ,гл. 10. Что касается структуры темалглютинина, то из полученных различии пептидных карт ясно, что гликопептиды даже с резко различными последовательностями аминокислот способны принимать конфигурацию   активного гемагглютииина.   В связи с этим понятно^почему .вирус гриппа так вариабелен ло «оим антигенным свойствам. Если бы стерические требования для образования биологически активного гемагглютинина были достаточно жестки, то не были бы возможны существенные, изменения в последовательности его аминокислот. И как следствие этого положения мутации в гемагглютинине вместо того, чтобы быть полезными вирусу, были бы для него губиТеЛБольшая часть углеводов, -входящих в состав субъединицы  НА,  по-видимому,  ассоциирована с гликопептидом  НАь В вирусе штамма АО/Bel в состав НА, входит в 5 раз больше глкжозамина, чем его находится в НА2, хотя эти два глико-пептида отличаются по содержанию белка только в 2 раза (Laver, 1971). Таким образом, углеводы «оставят большую часть в гликолептиде НАь чем в гликопептиде НА2. Кроме глюкозамина, в состав НА, входят «ругоза, галактоза и ман-нлчя YLaver   1971)    Сиаловая кислота, вероятно, в вирионе отс^вуе? (.Kl^ik, Choppin, 1970; Klenk et al., 1970)   jэднако может быть присоединена  к  обеим частям субъединиц НА (штамм A0/WSN) уже после сформирования цельных вирио-нов с помощью  специального  фермента   (Schulze,   197,3a,  D... см   также часть  IV этой  главы).  К НА, присоединялось в 5 раз больше остатков сиаловой шслоты, чем к НА2. Исполь зуемый фермент переносит остаток сиаловой кислоты с -цити-дУйн 5> моноРфосфатаР сиаловой .кислоты на лицевой  остаток галактозы, локализованный на гликопротеиде  (Bartholomew, Jourdian, 1966).

Образовались ли концевые галактоэные остатки гемагглю-тинина путем отщепления еиаловой кислоты с помощью нейр-аминидазы .или неполного синтеза углеводной цепи, — неизвестно. Фукоза—другой сахар, часто обнаруживаемый в концевом положении у олитосахаридов, не включен в НА2 некоторых вирусных штаммов, в то время как глюкозамин всегда входит в состав этого гликолелтида (см. гл. 2). Может ли фукоза включаться в состав сформированных вирусных частиц in vitro, — неизвестно.

Как видно из табл. 9, НА] и НА2 содержат .примерно равное молярное количество тирозина. Stanley и Haslam (1971), однако, обнаружили, что НА2, меньший из двух гли-конептидов, может быть йодирован в большей степени, чем НАь Таким образом, вероятно, остатки тирозина в НАрчасти НА менее доступны за счет конформационных ограничений.

И, наконец, аминокислотный состав гемагглютинина, выделенного из штамма B/Lee, как было показано Laver и Baker (1972), сходен с аминокислотным составом гемагглютинина АО/Bel эти исследователи также показали, «то в состав гликопептида HAj входит около 90% пролина гемагглютинина. Поскольку этот аминокислотный остаток препятствует образованию а-спиральной конфигурации, его неравное распределение между двумя частями субъединицы НА может иметь важные «информационные последствия.

2. Антигенные свойства гликопептида HAt

Поскольку (гликопептид HAi гемагглютинина ориентирован так, что находится в водной фазе, окружающей вирион, можно ожидать, что именно он должен содержать область (или области), которая взаимодействует с эритроцитами, клетками-хозяевами, растворимыми ингибиторами и антителами. Информация об этом в настоящее время еще недостаточна. Однако из штамма PR8 (НОШ) был изолирован ге-магглютининсвязывающий антиген (НАВА), вероятно, представляющий собой димер гликопептида HAi (Eckert, 1966, 1969, 1973). Это молекулярное образование не обладало ге-малглютинирующими свойствами, но реагировало с антителами, специфичными для вирусного гемагглютинина. При обработке детергентом и дитиотриэтолом антиген диссоциировал на фрагменты с молекулярной массой около 40 000. Антиген количественно удалял HI-антитела из иммунной сыворотки, приготовленной против целого вируса. Он, кроме того, индуцировал образование HI- и нейтрализующих антител. Состав аминокислот ,НАВА сходен с таковым гликопептида НАЬ выделенного из штамма АО/Bel. Однако, как уже указывалось, HAi и НА2, выделенные из штамма Bel, сходны по составу аминокислот  (исключая содержание .пролина), и их отличие может  быть выяснено  только  с помощью  методов определения последовательности аминокислот.

Эксперименты, проведенные Brand и Skehel (1972), также указывают, что HAi может содержать антигенные детерминанты, индуцирующие образование специфических против гемагглютинина антител. Полученный с помощью обработки бромелайном кристаллический гематглютинин давал одну полосу преципитации с антисывороткой против целого вируса или против HAj. Линия преципитации в реакции с антисывороткой против НА2 'наблюдалась только после добавления -к кристаллическому сгемагглютинину восстанавливающих агентов. Эти факты указывают на то, что функциональный антигенный центр интактного гемагглютинина локализован на гликопептиде НАЬ а дополнительный центр, расположенный на НА2, обнажается только после диссоциации HAi и НА2. Однако недавно было обнаружено, что каждая субъединица гемагглютинина содержит несколько антигенных детерминантов и что один из них теряется при выделении гемагглютинина с помощью обработки бромелайном (Laver et al., 1974; см. также гл. 10). Некоторые антигенные центры, вероятно, локализованы полностью на НАЬ в то время как другие могут частично или полностью включать участки гликопептида НА2. Воздействие расщепления субъединицы НА на антигенную активность этих центров еще предстоит изучить.

Субъединицы НА, изолированные из разрушенного с помощью детергента вируса, обладают гидрофобными свойствами. Например, удаление детергента из препарата разрушенного вируса приводит к образованию больших по размерам агрегатов, обладающих гематглютинирующей активностью. Вероятно, за эту способность субъединицы НА и агрегации ответствен гликопептид НА2. После отделения от HAi с помощью детергентов и восстанавливающих агентов молекулы НА2 образуют агрегаты даже в присутствии гуани-дингидрохлорида и дитиотриэтола (Laver, 1971). Однако субъединицы НА, экстрагированные из вирусной частицы с помощью бромелайна, не агрегируют (Laver, 1973). Такие субъединицы не обладают способностью агглютинировать эритроциты, но реагируют с антисывороткой против гемагглютинина, « выделенного из того же штамма с помощью SDS. Субъединицы содержат гликопептид НА2, молекулярная масса которого на 5000 меньше молекулярной массы аналогичного гликопептида, полученного из гемагглютинина при разрушении вируса с помощью детергента. Таким образом, при обработке бромелайном, вероятно, от НА2 отщепляется гидрофобная область, ответственная за способность субъединиц НА агрегировать в растворе.

Ранее Laver (1973) установил, что аминокислоты, включенные в гидрофобную область НА2, должны быть локализованы на одном (или обоих) конце молекулы, поскольку удаление этой области не приводит к деградации НА2 до фрагментов с малой молекулярной массой.

Совсем недавно Skehel и Waterfield (1975) показали, что обычный :и модифицированный с помощью брамелайна НА2 имеет идентичную последовательность аминокислот на N-KOH-це молекулы. Поэтому аминокислоты, отщепляемые броме-лайном, должны локализоваться на С-конце полипептида НА2. Эта часть НА2 длиной около 50 аминокислотных остатков содержит около половины всех остатков серина, входящих в эту молекулу. Считается, что приблизительно 21 аминокислотный остаток из 50 обладает гидрофобными свойствами.

4. Структура субъединицы НА

Схема строения субъединицы НА, базирующаяся на описанных в этой главе экспериментальных данных, представлена на рас. 13 и изображает субъединицу НА как молекулу гликопротеида с молекулярной массой около 80 000 с участком, чувствительным к действию трипсина, расположенным на расстоянии */з от конца молекулы. Гидрофобная область расположена у одного из концов субъединицы НА. Расщепление трипсинчувствятельвой связи (или связей) приводит к образованию двух гликопептидов, HAi и НА2, связанных друг с другом с помощью дисульфидных мостиков. Основываясь на содержании цистеина в гликопептидах НА2, приведенных в табл. 9, можно заключить, что не более четырех дисульфидных связей соединяют ее с гликопептидом HAi1. Восстанавливающие агенты разделяют эти расщепленные субъединицы на два лолипептида — НА] и НА2. Полипептид HAi содержит основную часть углеводной компоненты, а субъединица НА2 обладает гидрофобными свойствами. Некоторые из олигосахаридов, присоединенных как к НАЬ так и к НА2, имеют на конце галактозу, и к ним могут быть присоединены остатки сиаловой кислоты. Один или большее число антигенных центров расположены полностью на гликопептиде НАь а один дополнительный антигенный центр показан в составе НА2. Область связывания эритроцитов также локализована на НАь хотя НА2-область. молекулы может играть существенную роль при образовании активных олигомеров.

При расщеплении полипептида НА полипептид НА2, вероятно, отщепляется от его карбоксильного конца (Skehel, Waterfield,  1975), поскольку в результате расщепления образу-

ется N-'конец полипептида НА2 ;и С-конец полипептида i Skehel и Waterfield сравнили последовательность первых 10 N-.концевых аминокислотных остатков лолипептида НАЬ изолированного из трех антигенно различных штаммов вируса гриппа человека типа А. Последовательность аминокислот оказалась одинаковой за исключением одного или двух положений. Одинаковая последовательность аминокислот была также обнаружена для N-конца полипептида -НА2) выделенного из антигенно различных гемагглютининов. Было исследовано 5 штаммов вируса гриппа человека типа А и один штамм вируса гриппа типа В. Исследованный участок полипептида включал в основном гидрофобные аминокислотные остатки. В составе этого участка был, кроме того, найден палиндром из 7 аминокислот, который как полагают Skehel и Waterfield (1975), может служить участком узнавания для протеаз, расщепляющих субъединицу НА с образованием частей HAi и НА2.

Эти результаты, совместно с данными Laver и Webster (1972, 1973) по изучению вариабельности пептидных карт после расщепления трипсином, указывают на то, что последовательность аминокислот в некоторых частях молекулы гемагглютинина высококонсервативна, в то время как последовательность 1в других участках этой молекулы лабильна. Возможно, именно те области, в которых последовательность аминокислот меняется, ответственны за антигенную изменчивость, в то время как стабильные участки служат для поддержания трехмерной структуры активного гемагглютинина. В результате дальнейших, более интенсивных, исследований последовательности аминокислот в гемагглютинине, вероятно, будут выявлены размер вариабельного участка (или участков) в нем и доля аминокислот, которые могут быть заменены без нарушения структуры и функции субъединицы НА.

5. Антигенная гомогенность субъединиц НА

Как было указано выше, активный гемагглютинин включает более одной субъединицы НА. Это наблюдение совместно с тем экспериментальным фактом, что для некоторых вирусных штаммов в составе [гемагглютинина обнаруживается несколько различных антигенных центров, важен для выяснения вопроса о том, содержит ли индивидуальный вирусный штамм субъединицы НА с существенно различными последовательностями аминокислот. Этот вопрос имеет особое значение для вируса гриппа в связи с фрагментарностью его генома (см. гл. 6). Предполагалось, что при упаковке случайным образом фрагментов вирусной РНК (может произойти образование вирусных частиц с наличием экстракопий сегментов генома (Compans et al., 1970a). Поскольку в этом случае вирусные частицы были бы частично диплоидными, один вирусный штамм мог бы содержать генетическую информацию для синтеза двух различных типов субъединицы НА, если обе аллели пройдут через несколько циклов вирусной репродукции.

Один из способов выяснить, содержит ли вирусная частица один или несколько типов субъединиц НА, состоит в сравнении количества пептидов, обнаруживаемых с помощью тр'илтичеекого пептидного картирования субъединиц НА, с количеством пептидов, рассчитанным на основе содержания в субъединицах остатков лизина и аргинина. Это сравнение не может быть осуществлено в настоящее время, поскольку изучение цельной молекулы НА с помощью метода пептидных карт еще не проводилось.

Другой подход к решению этого вопроса состоит в использовании специфических антисывороток для выяснения того, разделены ли антигенные детерминанты пространственно. Используя этот метод, Laver и соавт. (1974) показали, что антисыворотка, приготовленная против одной из двух детерминант, 'ассоциированных с субъединицами НА, преципи-тирует обе детерминанты. Эти эксперименты являются первым аргументом в пользу пространственной связанности антигенных детерминант (т. е. локализация их на одной и той же субъединице НА). Опыты Laver и соавт. указывают также на то, что использованные штаммы не синтезируют двух различных в антигенном отношении субъединиц НА.

В. СТРУКТУРА «ШИПОВ» ГЕМАГГЛЮТИНИНА

1. Моновалентный гемагглютинин

Изолированные субъединицы НА с молекулярной массой 80 000 не обладают гематглютияирующей активностью. Наименьшей по  размерам  активной молекулой  является  олиго-мер, сформированный либо субъединицами НА, либо продуктами их расщепления—HAi и НА2. Этот моновалентный НА*1 был впервые изолирован из вириона с помощью SDS (Laver, 1964; Laver, Valentine, 1969). Он адсорбировался на эритроцитах, но не вызывал агглютинации. Гемагглютинин в присутствии SDS имел коэффициент седиментации, равный приблизительно 7,5S  (Laver, Valentine, 1969), и представлял собой палочкообразные частицы размером около 4-14 нм. Морфология этих образований показана на 33  (см. гл.  10). Ранее предполагалось, что моновалентный НА* имеет молекулярную массу около 150 000 и состоит из двух субъединкц НА  (Laver, Valentine,  1969). Эта точка зрения базировалась на размерах моновалентного НА*, полученных с помощью электронной    микрооколии,    на молекулярной массе субъединицы  НА, измеренной    с  помощью    электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии  SDS,  на  величине коэффициента седиментации моновалентного  НА.  При этом считали, что удельный парциальный объем равен 0,73 ем3/г. Однако позднее было показано, что моновалентный НА* представляет собой, вероятно, тример. Молекулярная масса, определенная методом     равновесной  седиментации,  оказалась равной приблизительно  215 000  i(Skenel,   Charlwood,  персональное сообщение). Эта величина примерно в 3 раза превышает величину молекулярной массы субъединицы НА. Кроме того, на электронных микрофото частично разрушенных вирусных частиц иногда обнаруживаются треугольные структуры соответствующих размеров, которые, вероятно, являются

«шипами» НА*1, наблюдаемыми «в торец» (Laver, 1973; Schulze, 1972, 1973). Этот вид (Молекулы в настоящее время твердо установлен с помощью экспериментов, когда кристаллическую каталазу смешивали с высокоочищенным НА*, изолированным с помощью SDS из вируса гриппа штамма АО/Bel (см. 33, гл. 10). В этих условиях молекулы НА* упаковываются регулярным образом так, что фактически все частицы наблюдаются «в торец». При негативном контрастировании каждая молекула представляет собой треугольник, что также указывает на то, что «шип» НА* состоит из трех субъединиц.

Сравнение морфологии и размеров слоя «шипов» на поверхности интактно.го вируса с размерами изолированного НА* однозначно подтверждает точку зрения, что молекулы моновалентного НА* соответствуют отдельным «шипам», извлеченным из липидного двойного слоя. Высвобождение НА* может осуществляться либо за счет использования (Молекул детергента, которые могут взаимодействовать с гидрофобной областью «шипа», либо с помощью отщепления гидрофобной области от НА2-части субъединицы при протеолизе. Одна вирусная частица содержит 300—450 «шипов» (Schulze, 1973), которые присоединены к липидному слою за счет (взаимодействия с ним НА2-частей тримеров. Некоторые штаммы вируса, вероятно, содержат менее одной молекулы HAj на молекулу НА2 ;(Schulze, 1973). Таким образом, некоторые «шипы» вир иона, содержащие расщепленный НА, могут иметь дефектную структуру1.

2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина

Как было указано, гемагглюти'нация имеется только при наличии мультивалентных молекул, которые могут быть сформированы in vitro в там случае, если НА2-часть субъединицы интактна. Такие агрегаты показаны на 34 (см. гл. 10). Поскольку они формируются из различного числа «шипов» НА*, агрегаты неодинаковы по размерам.

Процесс диссоциации «шипа» НА* и его агрегации с образованием частиц, вызывающих гемагглютинацию, представлены схематически на 14. «Шип» изображен как тример, причем гидрофобная область каждой из трех субъединиц НА* внедрена в двойной лилидный слой вирусной частицы. Эти гидрофобные области удаляются при изоляции НА* с помощью протеазы (см. 14,А).

Описанная  модель  основана  на  экспериментальных данных,  полученных  для (большого   числа   вирусных   штаммов,  однако не все детали схемы осуществляются для каждого отдельного штамма. Например, наблюдаются большие различия в чувствительности разных штаммов вируса к действию протеаз (Schulze, 1973). Протеазы инактивируют и, вероятно, разрушают НА* многих штаммов вируса (Kilbourne, 1969), однако в отношении некоторых из них имеет место протеазная инактивация, действующая не только исключительно яа НА*. Kilbourne и еоавт. показали, что НА-антиген может потерять чувствительность к лротеазе в процессе генетической рекомбинации (Kilbourne et al., 1972a). Эти наблюдения вместе с другими экспериментальными данными показывают, как опасно делать заключение о структурных перестройках на основе наблюдаемых изменений биологической активности. Действительно, описанная модель предполагает, что НА*, изолированный из вирусной частицы с помощью обработки (бромелайном, зде меняет своей структуры за исключением потери гидрофобной области. Однако такой НА*, изолированный из некоторых штаммов вируса, не адсорбируется на эритроцитах (Laver et al., 1974), что указывает на наличие структурных изменений в гидрофильной части субъединицы (в ее НАрчасти). Поскольку эти изменения -мотут быть крайне незначительными, их можно не заметить, если использовать имеющиеся в настоящее время физические методы.

IV. ФУНКЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Два важных аспекта, связанных с присутствием НА*, были ясны задолго до проведения детального анализа структуры вириона гриппа. После эпидемии гриппа в 1947 г. стало ясно, что поверхностные антигены вириона претерпевают кардинальные изменения своего состава и в связи с этим штаммы вирусов, обладающие одинаковым внутренним антигеном, показывают в перекрестных реакциях нейтрализации и подавления гемагглютинации низкую активность (Francis et al., 1947). Следовательно, было показано, что НА* является основным 'поверхностным антигеном и что он один стимулирует синтез антител, нейтрализующих инфекционность и ингиби-рующих темагглютинацию (Drzeniek et al., 1966; Laver, Kilbourne, 1966). Таким образом, был сделан вывод, что НА* ответствен за прикрепление вируса к клетке-хозяину или к эритроцитам и что изменения именно в его структуре влияют на антигенные свойства вирионов.

Как было показано в разделе III этой главы, некоторые из этих свойств остаются присущими НА* при его отделении от вирусной частицы. Изолированный НА* может адсорбироваться на эритроцитах и, если выполняются условия образования мультивалентных агрегатов, может вызвать гемагглю-тинацию. НА* вызывает образование HI и нейтрализующих

антител, если даже в качестве антигена используются обра

ботанные детергентом молекулы, не обладающие гемагглю-

тинирующей активностью. Эти антитела в очищенном виде

имеют высокую степень антигенной специфичности, так что

штаммовые различия, характерные для интактных вирибнов,

можно успешно исследовать при использовании субъединиц

в качестве антигенов.          :

После выяснения структуры вириона гриппа стало также

понятно, почему очищенные вирионы содержат <в своем соста

ве так называемый антиген хозяина. Было 'выяснено, что этот

антиген, обнаруживаемый и в очищенных препаратах вируса

(Knight, 1944; Harboe et al., 1961; Harboe, 1963), является

углеводной частью поверхностных гликопротеидов. Он пред

ставлял собой гликопротеид, лишенный остатков еиаловых

кислот (Hankenes et al., 1966; Laver, Webster, 1966), реаги

ровал с антителами к НА* и блокировал их Ш-активность.

Эти кросс-реакции наблюдаются в связи с тем, что НА* содер

жит олигосахариды, синтезированные ферментами клетки-

хозяина из пула подходящих углеводных остатков, которые

поэтому сходны с олигосахаридами, содержащимися в гли-

копротеидах клетки-хозяина.          . . . .

Информация, полученная при использовании в качестве объекта исследования изолированного НА*, была крайне полезна для выяснения структурных взаимоотношений внутри «шипа» НА* и в решении вопроса, какие части «шипа» способны связываться с лииидным двойным слоем, а какие — взаимодействуют с клеточными рецепторами. Однако понимание роли «шипа» НА* в присоединении вирионов к эритроцитам и к хозяйским клеткам возможно только при изучении НА* in 'situ. В связи с этим предпринимались попытки изменить НА*, входящий в состав вириона, для того, чтобы скор-релировать изменение в его структурной организации с изменениями в его свойствах.

16. Влияние присоединения остатков сиаловой кислоты на биологические свойства вируса гриппа. Очищенный вирус штамма A0/WSN инкубировали с ЦМФ-сиаловой кислотой и сиалилтрансферазой. Во время инкубации отбирали аликвоты для определения гемагглютинирующей и нейрами-нидазной активности и инфекционности. Нейрамииидазную активность определяли по скорости отщепления сиаловой кислоты от фетуииа с помощью колориметрического метода Aminoff (1961). Инфекциовность определяли методом подсчета бляшек в моноелюях клеток МДВК (Madin, Diarby, 1958) и фибропластов куриного эмбриона (CEF). Вирусные частицы с отщепленной с помощью трипсина нейраминидазой (ом. табл. 10) инкубировали в тех же условиях и их активность определяли тем же способом. Контроли, содержащие внтактный или трипсинизироваяный вирусы, инкубировали в той же среде за исключением ЦМФ-еваловой кислоты. После инкубации в течение 6 ч при 137 СС контроля обладали 100% гемагглютинирующей активностью и приблизительно 60 и 10% начальной инфекционности и нейраминидазной активности. 'Светлые значки относятся к трипеинизированном'у (вирусу  (Schulze, 1975).

Довольно неожиданные биологические последствия .присоединения к гем агглютинину in vitro остатков сиаловой кислоты суммированы на 16. Гемагглютинирующая активность теряется, нейраминидазная активность остается той же, как для инкубированного (Контрольного вируса, а и-нфекцион-ность в значительной степени растет. Степень роста инфекционности зависит от количества присоединенной сиаловой кислоты, от клеток, на которых проводилось определение инфекционности, и от того, был ли вирус предварительно обработан трипсином для удаления его собственной NA*1.

Остатки сиаловой .кислоты, присоединенные ,к интактному вирусу in vitro, могут быть удалены с помощью NA* сиали-зидированных вирионов, если будут созданы оптимальные для работы этого фермента условия (Schulze, 1975a, b). В связи с этим вполне вероятно, что вирусная NA* отщепляет от вирионного НА* остатки сиаловой кислоты, присоединяемые к нему сиалилтраноферазами клетки-хозяина. Доказательства в пользу такого механизма были впервые приведены Palese и соавт. (1974) и будут описаны в гл. 4. Однако ковалентное присоединение сиаловой кислоты к вирусным гликолротеидам или к их предшественнику in vivo еще не было осуществлено.

Механизм увеличения инфекционности гари ковалентном присоединении сиаловой «кислоты [в настоящее время выясняется. Поскольку наблюдаемая степень увеличения инфекционности частично зависит от того, какой тип клеток используется для определения инфекционности, вполне вероятно, что присоединение остатков сиаловой кислоты увеличивает степень связывания вирионов с какими-то клеточными рецепторами. В этой связи интересно отметить, что, по предварительным данным, сиализидированные вирионы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, по-видимому, присоединяются ,к куриным эритроцитам так же, как контрольные вирионы (Schulze, неопубликованные данные). Эти результаты указывают на то, что при некоторых условиях гемагглю-тинация является неточным индикатором наличия взаимодействия вирионов с рецепторами эритроцитов, не говоря уже о взаимодействии их с рецепторами хозяйских клеток.

Аналогичные изменения активности могут быть вызваны с помощью обработки вируса гриппа фетуином — гликопро-теидом, содержащим остатки сиаловой кислоты (Der, Schulze, 1975). Контакт вирионов с фетуином приводит к потере ими гемагглютинирующей активности и увеличивает инфек-ционность препарата (табл. 11). Для предотвращения деструкции ингибитора вирусной нейрамияидазой вирусные образцы обрабатывали трипсином перед инкубацией с фетуином. Обработанные трипсином препараты, не обладающие нейраминидазной активностью, теряли гемаатлютинирующую активность и значительно .увеличивали свою инфекционность после инкубации с фетуином. Удаление остатков сиаловой кислоты с фетуином в большой степени снижало его стимулирующее действие и обработанный фетуин переставал быть ингибитором    гемагглютинации.    Это  указывает  на  то, что

остатки сиаловой кислоты должны участвовать в изменении обеих активностей. Приведенные результаты показывают, что адсорбция вирионов на клетках-хозяевах может быть облегчена путем добавления некоторых водорастворимых глико-протеидов, содержащих в своем составе остатки сиаловой кислоты. Это увеличение инфекционности, так же как и в случае сиализидированных вирионов, может быть связано с образованием агрегатов, которые являются причиной инфекции, как это наблюдается при агрегатах неполных, но комплементационных вирусных частиц (Hirst, Pons, 1973). Независимо от того, какая из этих альтернатив в действительности имеет место, вероятно, настало время пересмотреть наши взгляды на роль сиалосодержащих гликопротеидов в инфекционном процессе, поскольку некоторые из этих молекул, по-видимому, стимулируют инфекцию вместо ее угнетения.

Вне зависимости от того, какой механизм ответствен за потерю гемагглютинирующей активности и увеличение инфекционности, приведенный выше экспериментальный материал подтверждает тот факт, что присоединение сиаловой кислоты к 1гемагглютинину или взаимодействие вируса с сиа-лосодержащими гликопротеидами приводит к возникновению инфекционных, но не агглютинирующих вирусных частиц. Инфекционные вирусные частицы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, наблюдались ранее в персистентно инфицированных культурах клеток (Gavrilov et al., 1972) в результате химиотерапевтической обработки мышей (Mag-rassi et al., 1966) и в процессе адаптации штаммов вирусов гриппа типа А2 к новым клеткам-хозяевам (Thibon et al., 1967). Поскольку ни в одном из этих случаев вирусные частицы не исследовали после их очистки, механизм ингибиро-вания гемагглютинации пока  еще не  ясен.  Thibon  и  соавт.

(1967) предположили, что в их опытах гемапглютинин на поверхности вириона присутствовал, поскольку он вызывал синтез HI-антител, но был замаскирован. Ингибиторы же вируса гриппа типа А2 в культуральной среде не обнаруживались.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большая часть приведенной в этой главе информации о вирусах гриппа 'была получена на штаммах вируса гриппа типа А. Хотя IB настоящее время имеется мало данных о вирусах других типов, структура НА* вируса гриппа типа В, по-видимому, очень сходна со структурой НА* вируса гриппа типа А (ом. гл. 2 и раздел III этой главы). О вирусах гриппа типа С здесь не упоминалось, поскольку в настоящее время сведения о структуре их НА* полностью отсутствуют.

Нам хотелось бы обсудить некоторые аспекты взаимодействия   между  вирусным НА* и эритроцитами.   Учитывая то, что мы знаем в настоящее время о молекулярной структуре рецепторов эритроцитов и вирусного НА*, можно сделать вывод, что явление гемагглютинации представляет собой взаимодействие между молекулами, которые очень сходны по своему составу и структуре, но резжо отличаются по своим зарядовым    свойствам.     Каж  вирусный   НА*,   так   и   вирусные рецепторы эритроцитов  являются  низкомолекулярными  гли-копротеидами,    склонными к агрегации    после их изоляции. В  нативном  виде  оба тликопротеида  имеют  специфические места, чувствительные к трипсину, оба гликопротеида имеют гидрофобную часть в области карбоксильного конца молекулы и гидрофильную область у N-конца. Эти свойства характерны для большинства ассоциированных с мембранами гликопро-теидов. Различие между этими двумя молекулами состоит в разном содержании в них остатков сиаловой кислоты. В то время как для гликопротеида эритроцитов содержание сиаловой кислоты составляет 27%, в вирусном гликопротеиде сиа-ловая кислота  отсутствует.   Поскольку  при физиологических значениях рН карбоксильная группа сиаловой кислоты находится в ионизированном состоянии, ионное окружение эритроцита должно значительно отличаться от ионного окружения вирусной частицы.

Многие особенности взаимодействия вируса с эритроцитами могут быть объяснены на основе этих различий в зарядовых свойствах. .В этой связи важно отметить, что адсорбция вирусов на эритроцитах не должна рассматриваться как явление, эквивалентное гемагглютинации. Хотя прикрепление вирусной -частицы к рецептору эритроцита и является необходимым условием гематоглютинации, оно не служит лимитирующим фактором при формировании сетчатой структуры или агрегата. Наличие различных точек зрения на процесс взаимодействия вирусных частиц с эритроцитами несомненно -было связано с тем, насколько мы были в состоянии изучать изолированно процессы вирусной адсорбции и .гемагглютинации. Во многих работах ставится знак равенства между адсорбцией и гемагглютинацией, поскольку в настоящее время еще не разработана методика изучения процесса адсорбции вирусных частиц на клеточную поверхность.

Кроме того, важно сознавать, жак мало мы знаем о химическом составе вирусных рецепторов, локализованных на клетках-хозяевах и играющих роль в инфекционном ироцессе. Естественно, однако, предполагать, что эти рецепторы резко отличаются от рецепторов эритроцитов. Гликопротеид эритроцитов человека содержит больше остатков сиаловой кислоты, чем гликопротеид плазматических клеточных мембран (Spiro, 1973). и его удельный вес в общем белковом содержании эритроцитов больше, чем удельный вес любого из гли-копротеидов плазматических мембран (Hughes, 1973). В то время как все остатки сиаловой кислоты могут быть легко удалены с поверхности эритроцитной мембраны с помощью нейраминидазы (Eylar et al., 1962), в других клетках некоторые из тажих остатков нечувствительны к обработке этим ферментом (Glick et al., 1970). (Предполагается, что эти нечувствительные к нейраминидазе остатки сиаловой жислоты локализованы на гликолипидах (Glick et al., 1970) и вовлечены в процессы адсорбции вируса и проникновения его в клетку (Haywood, 1974). Прикрепление вируса ж клеткам-хозяевам во многих случаях может быть проконтролировано путем -измерения инфекционное™ вирусной суспензии. Как и в случае гемагглютинации, этот метод индикации требует, чтобы осуществлялись все следующие за адсорбцией процессы. Таким образом, адсорбция вируса на клетку-хозяина и на эритроциты включает два независимых процесса и ни один из них не был ранее изучен с помощью таких методик, которые дали бы ответ на интересующие нас вопросы.

В свете всего изложенного хотелось бы отметить, что мы довольно опрометчиво дали название главному поверхностному гликопротеиду вируса гриппа. Для нас он является ге-магглютинином просто потому, что мы можем (количественно изучать процесс именно гемагглютинации, однако в вирусной частице этот гликопротеид играет другую роль. Хотя некорректно выбранное нами название этого гликопротеида и не может изменить его функцию, оно в .какой-то степени влияет на наше восприятие того, каж этот гликопротеид взаимодействует с клетками. Характерные черты гемагглютинина, приведенные здесь, в основном получены на основе экспериментов по определению его гемагглютинирующей активности. В настоящее время имеются более эффективные методики изучения  взаимодействия  вириона   с   клетками-хозяевами   и

с эритроцитами. Поскольку мы не можем рассчитывать на интуицию, которая помогла бы нам понять сущность явления без кропотливой работы, вполне вероятно, что ,мы лучше поймем наз'начение того 'поверхностного гликопротеида, (Которому мы дали название «гемагглютинин», если не будем пытаться найти прямую аналогию между его взаимодействием с эритроцитами и клеткой-хозяином.

 

ЛИТЕРАТУРА

Ada G. L., Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med., 1954, v. 32, p. 453.

Aminoff D. Biochem. J., 1961, v. 81, p. 348.

Bartholomew B. A., Jourdian G. W. In: Methods in Enzymology (E. F. Newfeld and V. Ginsburg, eds.), New York, Acad. Press, 1966, v. 8, p. 368—372. Bateman J. В., Davis M.  S., McCaffrey P. A. Am. J.  Hyg.,  1955, v.  62,

p. 349. Brand С. М.,  Skehel J. J.  Nature     (London),    New    Biol.,    1972,  v.  238,

p. 145. Burnet F. M., McCrea J. F.   Aust. J.  exp.    Biol.    Med.    Sci.,   1946,  v.  24,

p. 277. Burnet F. M., McCrea I. F., Stone J. D. Brit. J. exp.    Path.,    1946

Choppin P. W., Tamm I. Virology, 1959, v. 8, p. 539. Choppin P. W., Tamm I.  J. exp. Med., 1960, v. 112, p. 921. Chu С M. J. gen. Microbiol., 1951, v. 5, p. 739. Cohen A., Belyavin G. Virology

Cohen A., Belyavin G. Abstr. int. Congr. Microbiol.,  1966, 9th, p. 379. Compans R.  W., Dimmock N. J., Meier-Ewert H. In:  The Biology of Large

RNA Viruses  (R. D. Barry and B. W. J. Mahy, eds.), New York, Acad.

Press, 1970a, p. 87—108. Compans R. W., Klenk H.-D., Caliguiri L. A., Choppin P. W. Virology, 1970

Der C.-L., Schulze I. T. In preparation, 1975. Drescher  J.  Zbl.   Bakteriol.,   Parasitenk.,   Infektionskr.   Hyg.,   Abt.   I:   Orig

Drescher I. Am. J. Epidemiol., 1966, v. 84, p. 167. Drescher J, Am. J. Epidemiol., 1967,

Drzeniek R., Seto J. Т., Rott R. Biochim. biophys. Acta, 1966, v. 128, p. 547. Eckert E. A. J. Bacteriol, 1966, v. 92, p. 430. Eckert E. A.  J. Immunol., 1969, v. 102, p. 1105. Eckert E. A. J. Virol., 1973, v. 11, p. 183. Eylar E. H., Madoff M. A., Brody O. V., Oncley J. L. J. biol. Chem., 1962,

v. 237, p. 1992. Fazekas de St   Groth S., Gottschalk A. Biochim. biophys. Acta,  1963, v. 78,

p. 248.

Finter N. B. Virology, 1964, v. 24, p. 589. Francis T.  J. exp. Med., 1947, v. 85, p. 1. Francis Т., Salk J. E. Science, 1942, v. 96, p. 499. Francis Т., Salk J. E.,  Quilligan I. J., Jr. Am. J. pub.    Hlth,    1947, v. 37,

p. 1013. Frommhagen  L.  H.,  Knight  C. A., Freeman N.  K-  Virology,    1959,  v.  8,

p. 176. Gavrilov V. I., Asher D. M., Vyalushkina S. D., Ratushkina L. S., Zmieva R. G.,

Tumyan B. G. Proc. Soc. exp. Biol., 1972, v. 140, p. 109. Glick M. C, Comstock C,  Warren L. Biochim. biophys: Acta,  1970, v. 219.

 

 «Вирусы гриппа и грипп»       Следующая страница >>>

 

Смотрите также:

 

Медицинская энциклопедия

Энциклопедия народного целительства

 

Поиск по библиотеке:

 

  Грипп - Д. Львов член-корреспондент АМН СССР

  

Грипп Grippe, Influenza. Воздушно-капельные инфекции

 

  ГРИПП И ОСТРЫЕ РЕСПИРАТОРНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ. Народные средства от гриппа ...

 

  Простудные заболевания - ГРИПП

 

  Биография вируса. Д. Б. ГОЛУБЕВ профессор В. Е. ВИШНЯКОВ кандидат медицинских ...

 

  Грипп. Простуда - рецепты русской народной медицины и современной фармакопеи

 

  ВЗГЛЯДЫ НА ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА, СФОРМИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ...

 

  Грипп, парагрипп, аденовирусные инфекции и другие инфекции - В. В. ИВАНОВА

 

 Все результаты поиска (256)>>>