Вся библиотека >>>

Содержание >>>

 

Медицинская библиотека

Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина


Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А.

 

ГЛАВА 2. Стволовые клетки в эмбриогенезе мозга млекопитающих

 

10. Методические трудности получения  клонов НСК из ЭСК

 

В зародыше весь пул НСК нервной трубки образован механизмом нейрональной индукции из эктодермы. Первые нестин+ НСК в нервной трубке возникали у зародышей мыши 7,5 дня развития. Подобно эпибласту, нервная трубка - это уникальная плюрипотентная ткань, где числом формирующихся клонов НСК реализуется трехмерный проект мозга. На уровне первичных клонов пролиферация определяется превалированием сигналов noggin, SHH  над BMP-4 и BMP-7  механизмом “дефолта”. Дефолт в развитии –это автоматическая программа активации клеток после устранения ингибиторов (TGF-beta) ( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). Эти авторы  наблюдали частичную трансформацию ЭСК в НСК  в редкой культуре без фидера и сыворотки.  Существенно, что ЭСК при этом переходе не подвергались предварительной модификации в клетки первичной эктодермы. Присутствие фидерного мезенхимального слоя сдвигало баланс сигналов в пользу других производных эктодермы (эпидермис кожи). Факторы сыворотки также чаще всего блокировали нейрогенез из ЭСК. Из отдельных клеток формировались клоны НСК  с промежуточным фенотипом между ЭСК и  нейросферами, выделяемыми из концевого мозга новорожденных животных.  Единичные самообновляющиеся клоны НСК возникали при плотности  20 ЭСК/мкл и 1000 ед LIF. Другие добавки (B27 supplement, EGF, bFGF)  без LIF не индуцировали образование клонов НСК. Этот путь получения нейросфер нерентабелен из-за малой доли (0,2 - 0,4%)  образующихся колоний НСК. Показательно, что спектры мРНК  исходных ЭСК и колоний НСК  не претерпевали существенных изменений, кроме исчезновения мРНК  Oct4. В клонах сохранены мРНК всех генов трех зародышевых листков и ранних master-genes  рестрикционного созревания клеточных линий.  Плюрипотентность клонов НСК позволяла активно химеризовать ткани зародыша-реципиента после имплантации в морулу. С этой целью были получены нейросферы, стабильно меченые цветными белками. Пересаженные НСК активно мигрировали, пролиферировали как в головном мозге, так и  других органах зародыша ( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). В противоположность НСК зародыша, НСК  из мозга взрослых животных, теряли способность к химеризации зародышей ( Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J. Et al.,2000).

Судьба изолированных ЭСК зависела в основном от  эпигеномных синалов (noggin, notch, cerebrus, LIF, ВМР-4, ВМР-7). В культуре удалось понять причину блокировки нейрогенеза при высоких плотностях ЭСК -  мешают меклеточные взаимодействия  между слоями прогениторных клеток. Процент нестин+ клеток   снижался на 75-85%  в плотных культурах эмбриоидных телец. Многие авторы подтвердили, что  в культуре ЭСК  проще наладить получение нейронов, глии ( более сложно получить олигодендроциты), чем превратить эмбриоидные тельца  в нейросферы (  Okabe S., Forssberg-Nilsson K., Spiro A.C. et al., 1996; Brustle O., Jones K.N, Learish R.D. et al.,1999; Finley M.F.A.,Devata S.,Huettner J.E.,1999). Как известно, пересадки пролиферирующих тотипотентных ЭСК в мозг не практикуются из-за  риска малигнизации части клеток. Однако фракцию эмбриоидных телец с дифференцирующимися нейронами  удавалось пересаживать в мозг животных без осложнений. После пересадки в мозг часть клеток трансформировалась в нестин+ популяции клеток ( Benniger Y., Marino S., Hardegger R. et al., 2000).

 

<<< Содержание книги       Следующая страница >>>